RNA甲基化是表观遗传学领域的研究热点，也是高分文章的宠儿，目前大热点有m6A、m5C、m1A RNA甲基化，尤其m6A修饰热度只增不减，那么，本期我们继续m6A。这次分享的文章是发表在Nature Cell Biology上的“Stage-specific requirement for Mettl3-dependent m6A mRNA methylation during haematopoietic stem cell differentiation”，文章是关于造血干细胞（HSC）的研究，也关于m6A，主角分子依旧是Mettl3蛋白。

本文所有图片及数据均来源于：Lee, H., et al. "Stage-specific requirement for Mettl3-dependent m6A mRNA methylation during haematopoietic stem cell differentiation." Nature cell biology (2019).

研究背景：造血干细胞（HSCs）维持平衡的自我更新和分化，但这些功能如何被精确调节尚不完全清楚。m6A mRNA甲基化已成为影响许多生物过程中转录基因表达调控的重要模式。基于这些，作者开展了实验。利用Lysm-cre转基因技术小鼠Mettl3条件敲除后，髓系细胞的数量和功能并未被影响HSCs分化受阻。Myc的转录本是m6A最主要修饰靶基因，对HSC细胞进行MeRIP-seq，发现，Mettl3缺失的HSC细胞中，MYC的表达量下降，挽救实验中增加分化刺激因素或者人为上调表达MYC基因，都可以使得挽救HSC的分化功能缺陷。

研究结果：

1、Mettl3蛋白敲除后HSC细胞大量堆积

根据已有研究报道，HSCs可以直接产生血小板，通过腹膜注射pIpC到敲除Mettl3的Mx1-cre中，通过全血细胞计数分析显示Mx1-cre中血小板计数显着降低；Mettl3^fl/fl小鼠与pIpC处理的对照相比，白细胞计数也显著降低且分布改变，这表明m6A与造血功能相关；在pIpC最后一次注射，10天时，Mettl3的缺失导致髓系细胞的数量显著减少，脾细胞无变化；注射后2-4个月，除髓系细胞的数量显著减少之外，脾脏大小及细胞构成反而增加；在骨髓中，LSK和HSCs在检测的时间点都有增加，且HSCs在最后一次pIpC注射后10-14天到4个月持续增加，而LSK只是略有增加；另外，观察到Lin-Scal-cKit+CD150+CD41巨核细胞和CD41巨核细胞与对照相比显著增加。所有相关数据表明Mettl3的丧失导致HSC细胞堆积，并且影响巨核细胞谱系。

2、Mettl3蛋白缺失阻碍HSCs正常分化

BrdU注射Mx1-cre鼠，检测细胞周期、细胞死亡等指标，结果发现：Mettl3^fl/fl小鼠与对照相比，BrdU掺入并没有大的差异，但是细胞死亡显著增加；另外，使用5-氟尿嘧啶处理pIpC注射的Mx1-cre小鼠时，Mettl3^fl/fl小鼠的存活率低于对照组；这说明HSCs的积累可能是分化受阻而非自我更新增强。而后作者进一步利用甲基纤维素检测HSCs的分化能力，与对照相比，丧失Mettl3的HSCs形成集落更少且菌落更小，作者利用流式细胞术分析，发现这些细胞是不能分化的；但是，当Mettl3缺陷的髓系细胞接种到甲基纤维素中时，与对照相比，形成的集落在数量，大小和类型上相似，且这些菌落含有正常数量的分化细胞。这表明Mettl3的缺失导致HSCs的分化受阻，但在体外限制性祖细胞中不存在此现象。

3、Mettl3是HSCs分化过程的必需分子

为了测试Mettl3的缺失是否导致体内HSCs缺陷，作者通过利用Mx1-cre的500,000个髓系细胞进行竞争性重组测定。 发现HSCs水平有降低趋势；作者将Mettl3缺陷型和对照HSCs以及野生型竞争性髓系细胞分选出来，并移植到致死量照射的小鼠中，移植对照HSCs的受体鼠能够重组主要造血谱系，但缺乏Mettl3的HSCs不能重组，缺陷主要发生在骨髓和B谱系中，且缺乏Mettl3的HSCs在自我更新上基本是正常的，但是随着分化层次推移，所分化的造血细胞逐渐减少；这表明Mettl3缺陷型HSCs在造血重组方面存在缺陷，且Mettl3是HSCs分化过程的所必需的。

4、骨髓细胞生成不需要Mettl3

作者在Lysm-cre中敲掉Mettl3蛋白，6-8周龄的鼠各细胞参数正常（外周血、骨髓、脾细胞等参数），且都可以形成正常形态的巨噬细胞；当受到脂多糖攻击时，显示出的炎性细胞因子Tnfa，Il1b和Il6均正常上调；Mettl3缺陷型骨髓细胞也显示出强烈的吞噬活性，这个现象与对照相似；这说明Mettl3不是成熟骨髓细胞维持功能所必需的，但HSCs在体内造血分化期间对Mettl3和m6A的阶段特异依赖。

5、鉴定HSC中与m6A作用的靶基因

利用MeRIP-seq技术鉴定，发现在对照小鼠中，富集了2073个转录产物，而在Mettl3缺陷型HSCs的Mx1-cre中，经过pIpC处理10天，只富集了995个转录产物，与对照相比，显著降低；这说明m6A修饰与Mettl3蛋白的表达密切相关。此外，Myc, Junb 和 Tet2被认为是m6A修饰的主要靶基因，在Mettl3缺陷型HSCs中，这些基因的表达量也下调。

6、Mettl3介导的m6A会改变HSCs特性

作者在Mettl3缺陷型HSCs中找到384个上调基因，其中95个是m6A靶标，将基因分为m6A靶基因和非m6A靶基因，通过MeRIP-seq，发现与非m6A靶标相比，m6A靶标的转录物在Mettl3缺陷型HSC中具有略微增加的丰度，根据已有研究报导，在HSC中MYC蛋白水平非常低，在通过转录机制进行分化后被上调，MYC的缺失阻断HSCs分化，而更高水平的MYC蛋白可以促进HSCs分化，这个现象与Mettl3缺陷型HSCs的表型相似，因此，作者进一步通过MeRIP-seq技术检测，发现Mettl3缺陷型HSCs中MYC转录物水平没有显著变化，但是，GSEA基因富集分析结果发现Mettl3缺陷型HSCs中Myc-靶基因特征的显着降低，表明m6A可能主要调节Myc mRNA翻译，进一步在MYC蛋白中插入GFP蛋白，用来检测MYC蛋白表达量，结果：Mettl3的缺失导致HSCs中MYC-GFP的表达显着降低，在激活HSCs分化后，对照HSCs的MYC-GFP表达上调，而Mettl3缺失型HSCs的MYC-GFP表达不能上调，这说明m6A是HSC中Myc mRNA翻译所必需的，特别是在分化后。并且将Myc强制表达可以挽救由Mettl3缺失引起的HSCs分化缺陷。

文章总结：利用Lysm-cre转基因技术小鼠Mettl3条件敲除后，髓系细胞的数量和功能并未被影响，但HSCs分化受阻；Myc的转录本是m6A最主要修饰靶基因，对HSC细胞进行MeRIP-seq，发现，Mettl3缺失的HSC细胞中，MYC的表达量下降，挽救实验中增加分化刺激因素或者人为上调表达MYC基因，都可以使得挽救HSCs的分化功能缺陷；Mettl3所介导的m6A是HSCs分化过程中所必须的。